اکثر ژنها خیلی بلندتر از 400 نوکلئوتید طول دارند. برای sequence کردن آنها می بایست آنها را به قطعاتی که با هم overlap دارند تقسیم کرده و پس از sequence کردن تک تک قطعات و کنار هم قرار دادن قطعات مجاور، sequence کامل ژن مورد نظر را بدست آورد. راههای مختلفی برای ایجاد قطعات همپوشان وجود دارد مثلاً قطع کردن ژن با دو آنزیم محدود کننده مختلف مثل Sau3A و AluI. ازآنجا که ممکنست بعضی قطعات حاصل بیش از حد بلند بوده وامکان خواندن آنها نباشد اغلب مجبور خواهیم بود از چهار یا پنج آنزیم محدود کننده مختلف برای این منظور استفاده نمائیم.